铁死亡耐药是肿瘤进展的重要机制。IL-6是一种与肿瘤发生相关的主要炎症细胞因子。它通过激活上皮间质转化、转移和放射/化疗耐药促进肿瘤进展。在HNSCC患者汇总，IL-6水平的升高与肿瘤大小增加和淋巴结转移有关。
铁死亡是一种程序性细胞死亡，是生物科学研究的热点。它不同于凋亡或自噬，以铁介导的活性氧(ROS)生成为特征。xCT在神经胶质瘤、非小细胞肺癌和化疗耐药肝细胞中高表达，在一定程度上通过促进肿瘤增殖、化疗耐药和铁死亡耐药来促进肿瘤的发展。因此，xCT抑制促进铁死亡是传统放疗的一种潜在辅助治疗。
HNSCC是一种恶性肿瘤，可严重影响患者的外形和器官功能，给患者带来沉重的精神负担。炎症细胞因子环境提供了促进肿瘤的微环境。作者在该研究中探讨了xCT和铁死亡在HNSCC的机制研究。
作者对收集的正常、白斑和癌变组织标本进行了免疫组化(图1A)，4-HNE是由细胞脂质过氧化产生，可用于铁死亡的指标，发现在HNSCC中4-HNE和IL-6含量高于正常上皮(图1B、C)。晚期(III期和IV期)或低分化头颈鳞状细胞癌患者4-HNE水平显著升高，即脂质过氧化升高(图1D-G)。此外，癌变过程中IL-6表达上调与4-HNE相关(图1H)。这些结果表明IL-6的积累可能是由脂质过氧化的增加触发的。
图1：IL-6的积累与头颈部鳞状细胞癌发生过程中脂质过氧化的增加有关。
接着，为了研究xCT在癌变过程中的表达，作者对正常、白斑和HNSCC样本进行了免疫组化分析(图2A)，发现xCT表达增加与癌变过程中的脂质过氧化和IL-6水平相关(图2B和C)。xCT的免疫反应评分在癌变标本中明显高于白斑和正常标本。晚期HNSCC患者的xCT表达明显高于I期和II期(图2D)。Westernblot和qRT-PCR分析显示，与正常组织相比，SLC7A11基因在HNSCC样本和细胞株中被高度转录和翻译(图2E-H)。此外，高SLC7A11mRNA水平与较低的总生存率相关(图2I)。xCT过表达可能是肿瘤进展过程中增殖细胞克服ROS损伤障碍的关键。
图2：xCT表达增高与头颈部鳞状细胞癌预后不良相关。
通过克隆形成实验、CCK-8法测细胞活力、EdU法测定DNA复制能力，此外AnnexinV/PI染色和流式细胞术显示xCT敲除后早期凋亡细胞比例明显增加，提示xCT敲除能抑制HNSCC增殖（图3A-H）。
图3：xCT敲除抑制体外HNSCC增殖。
通过TEM检测xCT敲除的HN4和CAL27细胞发现大量萎缩的线粒体和线粒体嵴，揭示铁死亡的开始。使用FerroOrange荧光探针观察到细胞内亚铁离子升高（图4B和C），导致脂质过氧化。使用Liperfluo探针观察到xCT下调后脂质过氧化升高(图4D和E)。氧化型谷胱甘肽(GSSG)与GSH的比值在xCT敲除后显著增加(图4G)，表明细胞内处于氧化状态。xCT敲除可有效抑制肿瘤生长(图4I)，肿瘤重量和体积减小(图4J和K)。免疫组化发现，xCT敲除后，Ki-67表达下调，同时caspase-3裂解表达上调，TUNEL染色，表明生长能力受限(图4L-N)。此外，xct敲除组(si-SLC7A11#1#2)4-HNE表达显著上调，。这些结果表明，xCT作为一种“铁死亡拮抗剂”，在体内和体外均可诱导铁死亡拮抗。
图4：xCT敲除可诱导HNSCC的铁死亡。
IL-6作为促进肿瘤进展的促炎细胞因子，作者推测IL-6是HNSCC癌变过程中xCT的上游调节因子。在不同浓度和时间点给药IL-6，发现其以剂量和时间依赖的方式促进xCT的表达(图5A和B)，同时上调phospho-JAK2和phospho-STAT3的表达，提示JAK2/STAT3信号通路的激活(图5C)。siRNA或隐丹参酮阻断JAK2/STAT3通路后，IL-6促进的xCT表达被抑制(图5E和F)。IL-6给药后，荧光信号强度明显增强，提示转录因子与xCT启动子区域直接相互作用，可能为p-STAT3(图5G)。qRT-PCR分析显示，STAT3的下调逆转了IL-6诱导的SLC7A11mRNA水平的升高(图5H)。ChIP实验证实了p-STAT3与xCT启动子区域的直接相互作用(图5J)。p-STAT3的预测结合位点如图5I所示。这些结果表明IL-6通过JAK2/STAT3通路转录激活和促进xCT的表达，提示IL-6在HNSCC中的促肿瘤作用包括上调xCT的表达。
图5：IL-6通过JAK2/STAT3通路转录激活xCT表达
IL-6的加入使铁死亡症状减轻（图6A和B），并显著降低了xCT敲除引起的脂质过氧化（图6C-F）。xCT敲除后，最重要的铁拮抗物GSH的含量被IL-6部分逆转(图6G)。这可以部分解释促炎微环境下增殖细胞如何克服铁死亡。用CAL27细胞用体内实验证明IL-6显著增加了小鼠在erastin诱导的铁死亡下的肿瘤重量和体积(图6I和J)。IL-6降低了经erastin处理后升高的4-HNE水平(图6K和L)。总之，IL-6是一种新型的铁死亡的抑制剂，在体内和体外均可作为xct促进因子。进一步还发现IL-6通过上调xCT逆转铁死亡诱导的生长抑制。
图6：IL-6通过上调xCT在体内外逆转铁死亡
在该研究中，作者发现敲除或抑制xCT可以通过诱导铁死亡显著抑制HNSCC的增殖能力，进一步证明了IL-6在HNSCC癌变中的关键作用。IL-6通过JAK2/STAT3信号通路上调xCT，促进肿瘤进展，最终保护癌细胞免受铁死亡。该研究发现IL-6是HNSCC中第一个能够抑制铁死亡的炎症细胞因子，这拓宽了我们对癌变过程中炎症微环境的认识。
DOI：10./j.canlet..12.
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